方案一 Percoll自形成梯度:日立P28ST转头(6X40ml)
单管配置:Percoll原液6.5ml,0.25M蔗糖23ml加样品6ml,充分混合后注入40PA离心管至距管口3mm冰箱中预冷2小时后制备二管放入吊桶挂在P28ST转头上(其余4个空吊桶也要挂上),20,000rpm,1小时,5℃ 加速8,减速8。
结果:病毒沉降在Percoll 1.06密度处。
梯度取出:1)手工取出:离心管倾斜小角度后用定量吸管吸出,13ml PET离心管分别收集26管(每管0.5ml),PA管分别收集21管(每管0.5ml),各管分别测OD给出OD→离心管管容量曲线,可以看到病毒峰,确定离心管编号后即可移出,蔗糖可通过透析除去.2)仪器收集:用日立 DGF-U梯度形成一收集仪,每次做一个管子,DGF-U后出口接流动池的分光光度计,连续测OD并绘出曲线后分部收集,根据病毒峰的位置,可以确定病毒集中在哪些离心管中,透析后得到较纯病毒液.
方案二 蔗糖阶梯梯度
单管配置:用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度,离心管下部为45%(W/W)(PET管为4ml,PA管为3ml),上部为32%(W/W)(PET管为4ml,PA管为3ml),表面加样品至距管口3mm(约为4.5ml)。对称双管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小时,5℃ 加速8,减速7。
结果:病毒沉降在二个蔗糖梯度之间。
方案三 连续蔗糖梯度:日立CPMX或WX系列离心机,P40ST转头13PET管或13PA管。
单管配置:
1)13PET管:20%-50%(W/W)连续蔗糖梯度。
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度:用20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%(W/W)蔗糖液各1.5ml,从离心管低部逐层向上铺设(底部高密度),铺二管,直立在试管架上室温过夜,第二天早晨放入冰箱仅5℃预冷2小时。在蔗糖液上部加样品(约2ml)至距管口3mm。对称放入P40ST转头吊桶(转头及吊桶在冰柜中预冷过夜)对称双管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小时,5℃ 加速8,减速7。
2)13PA管:20%-50%(W/W)连续蔗糖梯度
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度:用20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%(W/W)蔗糖液各1.2ml,从离心管低部逐层向上铺设(低部高密度),铺二管,直立在试管架上室温过夜,第二天早晨放入冰箱5℃预冷2小时。在蔗糖液上部加样品(约2ml)至距管口3mm。对称放入P40ST转头吊桶(转头及吊桶在冰柜中预冷过夜)对称双管,38,000rpm(256,000Xg)X 1小时,5℃ 加速8,减速7。